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[Amplification] Real-time PCR의 정의와 특징

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작성일 2023-01-19 16:56:38 조회수 630
안녕하세요

바이오팩트 학술팀입니다. 

오늘은 Real-time PCR에 대해 간단히 설명드리겠습니다.


1. Real-time PCR (RT-PCR)
   : 일반적인 PCR과 달리 실시간으로 증폭 산물(PCR product)이 증폭되는 과정을 확인할 수 있으며 
     정량중합효소연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 또는 RT-qPCR 이라고도 합니다. 
   : Real time PCR은 형광물질을 증폭산물과 함께 실험하게 되는데, DNA 이중나선에 비특이적으로 끼어들어가 형광을 나타내는 Intercalationg Dye와, 
     Quencher를 이용하여 PCR 합성이 진행되면 형광을 나타내도록 하는 Probe 등이 사용됩니다.


2-1. Intercalacting Dye
    : 일반적으로 Real-time PCR에 사용되는 방식으로, 증폭되는 DNA(혹은 cDNA)에 결합된 dye의 형광을 검출하는 방식입니다.
     대표적으로 사용되는 SYBR Green I과 SFCgreen I, EvaGreen dye가 있고, 비특이적 증폭에 의한 false 신호가 발생할 수 있어 melting curve도 반드시 함께 분석해야 합니다. 


2-2. Probe 
      :  증폭 primer 외에 형광 dye가 결합된 probe도 첨가하여 검출하는 방식입니다. Target에 특이적인 Probe는 melting curve 분석이 필요 없으며, 
        Q-R primer가 결합된 region을 동시에 증폭할 수 있기 때문에 Multiplex PCR이 가능합니다. 


3. 두 방식의 장단점
    3-1. Probe 방식은 Oilgo 형태로 Target DNA 서열에 맞게 Design 해주어야해서 정확하긴 하지만 번거로운 단점이 있고
    3-2. Intercalacting 방식은 비특이적 결합으로 간편하지만 정확도는 Probe 방식에 비해 낮습니다. 


4. Real-time PCR 용어
   Real-time PCR 분석을 하기전에 몇가지 알아야할 단어를 알려드립니다. 

   4-1. Threshold - 증폭이 활발 한 구간 (통계적 유의성을 보여주는 신호수준)
   4-2. Ct (Threshold Cycle) - Threshold와 접점을 나타내는 형광 신호에서의 cycle수(증폭이 시작되는 Cycle)
   4-3. Melting Curve (Dissociation Curve) - Real-Time PCR 반응이 잘 일어났는지/primer dimer는 없는지/반응 특이성 확인 가능 


감사합니다.



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